Efectos de la privación repetida del sueño sobre los pericitos cerebrales en ratones

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12760 (2023) Citar este artículo

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Se han estudiado ampliamente los efectos dañinos de la privación de sueño (DS) sobre el parénquima cerebral. Sin embargo, aún no está clara la influencia específica de la SD sobre los pericitos cerebrales, un componente primario de la barrera hematoencefálica (BHE) y la unidad neurovascular (NVU). El presente estudio examinó cómo la SD aguda o repetida afecta los pericitos cerebrales midiendo los niveles en el líquido cefalorraquídeo (LCR) del receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas soluble (sPDGFRβ) y cuantificando la densidad de pericitos en la corteza, el hipocampo y el área subcortical del PDGFRβ-. Ratones P2A-CreERT2/tdTomato, que expresan predominantemente el indicador tdTomato en pericitos vasculares. Nuestros resultados mostraron que una SD única de 4 h no cambió significativamente el nivel de sPDGFRβ en el LCR. Por el contrario, la SD repetida (4 h/día durante 10 días consecutivos) elevó significativamente el nivel de sPDGFRβ en el LCR, lo que implica daños explícitos en los pericitos debido a la SD repetida. Además, la SD repetida disminuyó significativamente las densidades de pericitos en la corteza y el hipocampo, aunque el estado de apoptosis de los pericitos se mantuvo sin cambios, medido con el ensayo de afinidad de anexina V y la tinción activa con Caspasa-3. Estos resultados sugieren que la SD repetida causa daño y pérdida de pericitos cerebrales a través de vías no apoptóticas. Estos cambios en los pericitos pueden contribuir a las disfunciones BBB y NVU inducidas por SD. La reversibilidad de este proceso implica que la mejora del sueño puede tener un efecto protector sobre los pericitos cerebrales.

El sueño regula la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE) y promueve la eliminación de metabolitos1,2,3. Por ejemplo, la eliminación de beta amiloide (Aβ) es más eficaz durante el sueño que durante la vigilia4. Por el contrario, la pérdida de sueño o la vigilia prolongada perjudican la función de la BHE y se convierten en un factor de riesgo para la acumulación de Aβ en la enfermedad de Alzheimer5,6,7. Hallazgos recientes también sugieren que el sueño, especialmente el sueño de ondas lentas (SWS) o el sueño con movimientos oculares no rápidos (NREM), organiza las oscilaciones del flujo sanguíneo cerebral (FSC) y del líquido cefalorraquídeo (LCR) para la eliminación de metabolitos8,9. Sin embargo, aún no está claro el mecanismo celular exacto que media los efectos del sueño sobre la BHE y otros eventos neurovasculares. En otras palabras, el puente que conecta las oscilaciones neuronales y vasculares características durante el SWS sigue siendo desconocido.

Las células murales cerebrales incluyen pericitos y células del músculo liso vascular (vSMC). Los pericitos son un componente crucial de la unidad neurovascular (NVU) y la BHE que desempeñan un papel vital en la regulación del FSC, el mantenimiento de la integridad de la BHE, la liberación de factores neurotróficos y otras funciones aún por comprender10,11,12,13. La constricción y dilatación de los pericitos controlan la fluctuación del FSC, que constituye la base de las herramientas de imágenes funcionales BOLD (dependientes del nivel de oxígeno en la sangre), como la resonancia magnética funcional (fMRI) y la PET (tomografía por emisión de positrones), para predecir cambios en la actividad neuronal14. 15,16. Dado que las funciones del FSC y la BHE están reguladas por el sueño8,9,10,17,18, resulta intrigante preguntarse si los pericitos son uno de los objetivos celulares del sueño al meditar sus funciones, como la eliminación de metabolitos y el mantenimiento de la integridad de la BBB, y si la interrupción del sueño/ la pérdida afecta las funciones cerebrales al dañar los pericitos. Hasta ahora, estudios mínimos han asociado el sueño o el ritmo circadiano con los pericitos. Un estudio demostró que la eliminación del gen del reloj bmal1 (proteína 1 similar a Arnt del cerebro y los músculos) provoca una pérdida grave de pericitos y cambios profundos en la permeabilidad de la BHE19, lo que implica la importancia del ritmo circadiano en la salud de los pericitos. Un estudio reciente demostró que la expresión del gen bmal1 en pericitos promueve la maduración de los vasos en un modelo de estructura de tejido 3D20. El otro estudio demostró que la pérdida de sueño con movimientos oculares rápidos (REM) en ratas induce el desprendimiento de pericitos de las paredes capilares21. El presente estudio evalúa minuciosamente el daño pericítico causado por la privación de sueño aguda (TEA, una sola vez, 4 h) y repetida (RSD, 4 h/día durante 10 días consecutivos) con un modelo que priva tanto del sueño REM como del NREM mediante plaquetas en el LCR. Medición del receptor beta del factor de crecimiento derivado (PDGFRβ) y un método de cuantificación de pericitos basado en citometría de flujo. Se incluyó un grupo de recuperación (RSDR, 3 semanas de recuperación después de RSD) para examinar si los cambios en los pericitos inducidos por SD eran reversibles (Fig. 1, diagrama de flujo).

Diagrama de flujo del experimento: el grupo con TEA recibió una SD una vez el día 30; el grupo RSD recibió 10 días SD entre los días 21 y 30; el grupo RSDR recibió 10 días SD entre los días 1 y 10; No se impuso ninguna SD al grupo de control (SDC). Todos los ratones recibieron inyecciones de tamoxifeno entre los días 12 y 16 y fueron sacrificados dos semanas después de la inyección de tamoxifeno (día 31). Por tanto, la duración de la expresión de tdTomato fue la misma en todos los grupos.

Los ratones Pdgfrβ-P2A-CreERT2/tdTomato expresan el indicador tdTomato en pericitos vasculares después de la inducción con tamoxifeno. De acuerdo con otros estudios que utilizaron modelos de ratón similares basados ​​en el promotor PDGFRβ, la señal fluorescente tdTomato inducida por la inyección de tamoxifeno mostró localizaciones perivasculares predominantes que incluyen arteriolas, capilares y vénulas en el cerebro del ratón22,23,24. Sin embargo, los somas ovoides tdTomato+ protuberantes característicos de los pericitos se distribuyeron predominantemente en la pared capilar, arteriola precapilar y vénula poscapilar. Los pericitos capilares delineados por la fluorescencia de tdTomato se extienden como un proceso delgado alrededor de la luz del vaso (pericitos de hebra delgada) o tienen procesos en forma de malla (pericitos de malla). Rara vez se observaron somas TdTomato+ en el parénquima cerebral, la arteriola penetrante y la vénula ascendente (Fig. 2A, B).

(A – B) Distribuciones de pericitos tdTomato+ en la corteza de un ratón en el grupo de control. I: pericitos monocatenarios; II: Pericitos en malla. PA: Arteriola penetrante; PV: Vena penetrante. (CF): vasos sanguíneos marcados con lectina (verde), tdTomato (rojo) y CD13 (azul). Las flechas en el panel (F) indican pericitos capilares CD13+/tdTomato+. Barra de escala = 25 µm.

Para verificar la especificidad de pericitos de la expresión de tdTomato, examinamos el co-etiquetado de tdTomato con inmunotinción de CD13 (aminopeptidasa N), un marcador de superficie primario para pericitos cerebrales25,26. En secciones de cerebro, la distribución de las inmunorreactividades de CD13 varió. Estuvieron presentes inmunorreactividades evidentes de CD13 en la mayoría de las áreas del cerebro, donde aproximadamente el 98% de las células CD13+ también expresaron tdTomato (CD13+/tdTomato+) (Fig. 2C,F). Sin embargo, encontramos que las inmunorreactividades de CD13 estaban ausentes o eran muy débiles en algunas áreas corticales y subcorticales donde estaban presentes numerosas células tdTomato+ y vasos sanguíneos marcados con lectina (Fig. 3). Dado que es poco probable que los capilares y pericitos estén ausentes en áreas cerebrales tan extensas, creemos que el marcado negativo de CD13 en estas áreas del cerebro probablemente se debió a la limitación de la técnica de inmunotinción, que puede no detectar niveles bajos de expresión de CD13. El mismo patrón de distribución también se aplicó a la inmunotinción de PDGFRβ (consulte la figura complementaria S1). Por lo tanto, en el siguiente estudio de citometría de flujo, utilizamos el indicador genético tdTomato en lugar de CD13 para la cuantificación de pericitos para evitar la subestimación de las densidades de pericitos.

La discrepancia entre la inmunotinción de CD13 y la expresión de tdTomato en términos de etiquetado de pericitos. El panel (C) demuestra inmunorreactividades densas de CD13 en el área rodeada por un círculo amarillo en la corteza motora de un ratón de control. Sin embargo, las inmunorreactividades de CD13 fueron pequeñas o indetectables en el área adyacente con círculos blancos, aunque ambas áreas tenían una cantidad similar de distribuciones de lectina (A) y tdTomato (B). Las flechas amarillas muestran las células CD13+/tdTomato+. Las flechas blancas indican las células CD13-/tdTomato+. Barra de escala = 50 µm.

Los pericitos cerebrales lesionados eliminan sPDGFRβ al LCR. Por lo tanto, un nivel elevado de sPDGFRβ en el LCR se ha convertido en un marcador sensible de lesión pericítica. Los niveles de sPDGFRβ en el LCR en los grupos de control (SDC), ASD, RSD y RSDR se midieron con un ensayo ELISA. El nivel promedio de sPDGFRβ en el LCR en los ratones SDC fue de 1964 ± 638,0 pg/ml, casi la mitad del nivel de sPDGFRβ en el LCR de humanos jóvenes27. El análisis ANOVA mostró diferencias significativas en el nivel de sPDGFRβ entre cuatro grupos (F3,24 = 10,39, p = 0,0001). La ASD no cambió significativamente el nivel de sPDGFRβ en el LCR (2052 ± 513,9 pg/mL, t = 0,11 dF = 24, p > 0,99 en comparación con el grupo SDC). Sin embargo, la RSD aumentó drásticamente el nivel de sPDGFRβ en el LCR, casi tres veces más alto que el grupo SDC (5827 ± 2821,0 pg/mL. t = 4,64 y 5,01 en comparación con los grupos SDC y ASD, respectivamente, dF = 24, p < 0,001). Una recuperación de 3 semanas disminuyó el nivel de sPDGFRβ en el LCR hasta el nivel inicial (2945 ± 595,3 pg/mL, t = 1,14, dF = 24, p > 0,99 en comparación con el grupo SDC) (Fig. 4). El nivel sin cambios de sPDGFRβ en el LCR en ASD indicó que una SD única de 4 h no causó daño notable a los pericitos. Por lo tanto, no incluimos el grupo ASD en los siguientes experimentos de citometría de flujo para minimizar la cantidad de animales utilizados.

Los resultados del ensayo ELISA mostraron que el nivel de sPDGFRβ en el LCR en el grupo RSD fue significativamente mayor que el de otros grupos (**: p < 0,001; *: p < 0,05).

La caspasa-3 escindida es un marcador valioso de la apoptosis y, por lo general, no se puede detectar en células sanas. Se observó un aumento de la inmunorreactividad de Caspasa-3 escindida en el citoplasma de las células del parénquima cerebral en los ratones RSD, pero las células Caspasa-3+/tdTomato+ escindidas rara vez se observaron en todos los grupos, lo que implica que no hubo apoptosis de pericitos pronunciada inducida por SD repetida ( Fig. 5A – C, Fig. Suplementaria S5).

(A – C) La inmunotinción con caspasa-3 escindida da como resultado la corteza de un ratón RSD. Se observaron inmunorreactividades positivas (flechas) en el parénquima cerebral, pero no se co-localizaron con la fluorescencia de tdTomato. (D – F) Tinción de lectina en la corteza de ratones SDC (D), RSD (E) y RSDR (F), respectivamente. No se observó ningún cambio significativo en la densidad vascular. Barra de escala = 50 µm.

La lectina (Lycopersicon esculentum) se usa comúnmente para visualizar vasos sanguíneos debido a su capacidad para unirse a la membrana basal de las células endoteliales (CE). El porcentaje del área cubierta por la tinción con lectina es un índice confiable de densidad vascular y se ha utilizado para cuantificar los vasos sanguíneos en muchos estudios. No encontramos diferencias grupales significativas en las densidades del área vascular en la corteza y el hipocampo entre los tres grupos, lo que indica que nuestro procedimiento de SD no cambió significativamente la estructura general de los vasos sanguíneos del cerebro ni causó daño/pérdida grave de EC (Fig. 5, DF). ; Figura complementaria S2).

La fluorescencia de TdTomato en el cerebro fue potente y en todo el sistema vascular, lo que hizo que algunos somas de tdTomato+ fueran irreconocibles, lo que introducirá un sesgo si contamos los pericitos en secciones del cerebro con el método de morfometría tradicional. Por lo tanto, aplicamos el método de citometría de flujo para cuantificar los pericitos en tres áreas del cerebro (corteza, hipocampo y áreas subcorticales). En el grupo SDC, alrededor del 5,33 ± 1,19 % de las células del hipocampo, el 10,53 ± 0,84 % de las células corticales y el 9,68 ± 3,64 % de las células subcorticales eran células tdTomato+. El rango de densidad de pericitos que obtuvimos es mucho mayor que el del estudio de Crouch de 2018 (~ 2%), pero comparable con el estudio de Spitzer de 2013 (10-20%)26,28. Factores como los procedimientos de aislamiento de tejidos, la concentración de proteasa digestiva y la selección de anticuerpos pueden afectar los resultados de la citometría de flujo. Para permitir comparaciones significativas, nos aseguramos de que todas las condiciones experimentales fueran consistentes en todos los grupos.

La SD repetida durante diez días disminuyó significativamente la densidad de células tdTomato+ en el hipocampo a 3,17 ± 0,46 % (t = 4,15 dF = 15, p = 0,0026) y en la corteza a 8,17 ± 1,45 % (t = 3,30, dF = 15, p = 0,015 ). Las densidades de células tdTomato+ en el área subcortical no difirieron significativamente entre los tres grupos. Después de una recuperación de 3 semanas de SD repetida, las densidades de células tdTomato+ en la corteza y el hipocampo se restauraron al nivel inicial (Fig. 6). Las densidades de pericitos apoptóticos (tdTomato+/Anexina V+) fueron muy bajas en las tres regiones del cerebro, y las diferencias en la densidad de pericitos apoptóticos (proporción de células tdTomato+/Anexina V+ a células tdTomato+) entre cada grupo fueron insignificantes (Fig. 7).

(A) Fotografías representativas de las densidades de pericitos (tdTomato+) medidas con citometría de flujo en tres regiones. (B – D) Comparaciones de la densidad de pericitos entre tres grupos en diferentes áreas del cerebro. RSD redujo significativamente las densidades de pericitos en el hipocampo (B) y la corteza (C) (*: p <0,05; **: p <0,01). Sin embargo, después de una recuperación de 3 semanas, se restauraron las densidades de pericitos en el hipocampo y la corteza, sin diferencias significativas con respecto al grupo de control de SDC.

(A) Fotografías representativas de las proporciones de células tdTomato+/Anexina V+ a células tdTomato+ medidas con citometría de flujo en tres áreas del cerebro. (B – D) Comparación de las densidades de pericitos apoptóticos (tdTomato+/Anexina V+). No se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos.

Las células murales vasculares del cerebro incluyen células del músculo liso (vSMC) y pericitos. Los pericitos son muy abundantes en la microvasculatura del sistema nervioso central (SNC). Se ha informado daño o pérdida de pericitos cerebrales en diversos trastornos del SNC, incluido el accidente cerebrovascular isquémico, la enfermedad de Alzheimer (EA) y la retinopatía diabética29,30,31,32,33. Nuestro estudio demostró que la privación repetida del sueño (DS) alteraba los pericitos tanto a nivel molecular como celular.

SD es un enfoque tradicional para estudiar la función del sueño y los efectos del insomnio o la vigilia prolongada en animales. Sin embargo, los métodos comúnmente utilizados, como el manejo suave, el funcionamiento de ruedas, el disco sobre el agua o las plataformas múltiples, a menudo resultan en SD parcial (como solo SD REM) o despertares/excitaciones frecuentes, actividades de locomoción excesivas y estrés sistemático inevitable. que confunden los efectos reales de la pérdida de sueño34,35,36,37. Para abordar estos inconvenientes, ha surgido el sistema SD automatizado basado en barras giratorias. El control remoto de la barra giratoria minimiza el estrés inducido por el experimentador, mientras que la velocidad de rotación ajustable evita que los animales se queden dormidos. Además, nuestro sistema de barra giratoria es único en el sentido de que los ratones no necesitan caminar activamente sobre la barra; en cambio, la altura de la barra aplica suaves empujones en la cabeza o el hombro para despertar a los animales sin aumentar notablemente su locomoción (consulte la Figura complementaria S4). Como resultado, los cambios en los pericitos encontrados en nuestro estudio pueden atribuirse únicamente a la SD y no a la locomoción. Se realizó un registro EEG/EMG de 24 h para validar nuestro sistema SD (consulte las figuras complementarias S3 y S4).

En ratones, PDGFRβ se expresa predominantemente en pericitos38, mientras que en humanos, tanto los pericitos como las vSMC expresan PDGFRβ, con una abundancia relativa de proteína de PDGFRβ cuatro veces mayor en los pericitos que en las vSMC39. Es importante destacar que el PDGFRβ en los pericitos, pero no en las vSMC, se escinde y se elimina en el LCR durante la hipoxia y otras lesiones. Por lo tanto, el PDGFRβ elevado en el LCR se ha convertido en un biomarcador sensible de lesión de pericitos asociado con la degradación de la BHE y la disfunción cognitiva temprana en humanos27,31,39,40,41. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se midió el sPDGFRβ del LCR en ratones.

La ASD única de 4 h no logró aumentar el nivel de sPDGFRβ. Sin embargo, la RSD provocó un aumento triple en el nivel de sPDGFRβ en el LCR, lo que sugiere cambios patológicos graves inducidos por la RSD en los pericitos, incluida la eliminación del receptor de membrana degradado PDGFRβ en el LCR. Dado que las CE secretan el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el ligando endógeno de PDGFRβ, la pérdida rápida y masiva del receptor de superficie PDGFRβ puede alterar la comunicación cruzada normal entre los pericitos y las CE, que es crucial para la proliferación de pericitos. migración y, por lo tanto, eventualmente puede resultar en la muerte de los pericitos 42,43,44. Sin embargo, los ratones a los que se les dio un período de recuperación de 3 semanas después del mismo procedimiento repetido de SD de 10 días lograron mantener el nivel de sPDGFRβ en el LCR en el nivel inicial, lo que indica que los pericitos han detenido la eliminación de PDGFRβ después de que se abolió la SD.

El sueño es esencial para diversas funciones fisiológicas y la homeostasis. La comprensión moderna es que un complejo circuito neuronal en el cerebro regula los estados de sueño/vigilia, bajo el control de dos mecanismos biológicos internos: el ritmo circadiano y la homeostasis45. Sin embargo, cada vez hay más pruebas que indican que muchos elementos no neuronales, como las células gliales, el sistema microvascular, la BHE y el sistema inmunológico, también influyen en los circuitos neuronales o las neuronas locales y contribuyen significativamente a la regulación y la homeostasis del sueño3,46,47,48 .

Por lo tanto, la SD podría dañar no solo los sustratos neuronales sino también estos elementos no neuronales, que pueden incluir los pericitos cerebrales, ya que son un componente vital de la BBB y la NVU. Sin embargo, la evidencia directa de las interacciones entre el sueño y los pericitos es escasa. La evidencia indirecta sugiere que los cambios en la permeabilidad de la BHE causados ​​por el ritmo circadiano y la pérdida de sueño están mediados por los pericitos1,3,10,17,18. Hasta ahora, solo un estudio publicado ha examinado el efecto directo de la SD sobre los pericitos, en el que encontraron que la SD interrumpía la interacción entre los pericitos y las CE y disminuía los niveles microvasculares de PDGFRβ en el tejido cerebral de ratas21. Sin embargo, el modelo de múltiples plataformas utilizado en este estudio produjo una DE parcial que reduce la mayor parte del sueño REM pero sólo una parte del sueño NREM49.

Debido a que la posible participación de los pericitos en la generación de oscilaciones del FSC y del LCR ocurre principalmente durante el sueño NREM (o sueño de ondas lentas)8,50, postulamos que un procedimiento de SD que produzca la pérdida tanto del sueño NREM como del REM puede tener un mayor impacto en el sueño. pericitos. De hecho, demostramos que nuestro modelo SD repetido resultó en una pérdida significativa de pericitos en la corteza cerebral y el hipocampo, acompañada de un aumento de los niveles de sPDGFRβ en el LCR. Estos cambios contribuirán inevitablemente al daño BBB o NVU observado en SD.

Los mecanismos que median en estas pérdidas o anomalías de pericitos aún no están claros. Estudios anteriores han demostrado que los pericitos del cerebro o de la retina sufren apoptosis en determinadas condiciones, como niveles elevados de glucosa y enfermedad de Alzheimer29,51,52. Sin embargo, la pérdida de pericitos inducida por SD puede tener diferentes mecanismos ya que nuestro estudio no pudo detectar ninguna señal significativa de apoptosis de pericitos. De acuerdo con nuestros resultados, el estudio de Medina-Flores tampoco encontró cambios en el nivel de expresión de Caspasa-3 activada en microvasos cerebrales aislados de ratas privadas de sueño. La necrosis (muerte celular no apoptótica) es el otro mecanismo principal de muerte celular, que podría visualizarse mediante tinción con anexina V-/PI+ en el estudio de citometría de flujo. Sin embargo, nuestros datos no fueron adecuados para calcular la necrosis inducida por SD porque algunas de estas células de Anexina V-/PI+ pueden morir debido a los procedimientos de preparación del tejido.

Además de la muerte celular, la pérdida de pericitos inducida por SD puede atribuirse a la transición de pericitos a otros tipos de células. Los estudios han demostrado que los pericitos tienen el potencial de diferenciarse en otros tipos de células específicas de tejido bajo ciertas circunstancias in vitro e in vivo53,54,55,56. Por ejemplo, los pericitos cerebrales pueden adquirir un fenotipo de microglía expresando marcadores de microglía como IBA1 después de un accidente cerebrovascular isquémico57. Por lo tanto, se necesitan más estudios para explicar el mecanismo exacto de la pérdida de pericitos inducida por SD.

Las CE vasculares son otro componente importante de la BHE. Aunque múltiples estudios han demostrado que la SD puede afectar las funciones endoteliales y contribuir a disfunciones cardiovasculares como la hipertensión58,59, no se ha informado de daño o pérdida sustancial de CE inducida por la SD. De hecho, la muerte o pérdida masiva de CE sólo se produce en caso de lesiones cerebrales graves, como un accidente cerebrovascular isquémico o una ataxia neurodegenerativa, cuando se produce la degradación microvascular60,61. No detectamos ningún cambio significativo en la densidad vascular en la corteza y el hipocampo al comparar los porcentajes de áreas teñidas con lectina entre los tres grupos. Este hallazgo sugiere que nuestro procedimiento repetido de SD no causó cambios notables en las CE ni en la estructura general de los vasos sanguíneos. También implica que los pericitos son más sensibles a la SD que las CE, y la pérdida de pericitos inducida por la SD repetida no fue consecuencia de una pérdida masiva de microvasos.

El otro hallazgo importante del presente estudio es que el daño y la pérdida de pericitos causados ​​por SD repetida durante 10 días podrían revertirse si se restableciera el ciclo normal de sueño/vigilia. Las fuertes capacidades de proliferación y reparación del pericito podrían explicar esta inversión42. Estas capacidades también son cruciales para la reparación de la microvasculatura y el mantenimiento de la integridad de BBB y NVU en otras condiciones fisiológicas y patológicas.

En lugar de utilizar un modelo de SD total o extendido, el presente estudio utilizó un modelo de SD moderada (4 h/día) porque, clínicamente, la SD de leve a moderada es más común que la SD total en la vida cotidiana62. Por lo tanto, no sabemos si una DS más grave (> 4 h/día y > 10 días) o una DS total podría causar daño o pérdida irreversible de pericitos. Otra limitación es que no medimos los cambios de permeabilidad de la BBB inducidos por SD. Por lo tanto, no podemos examinar las posibles correlaciones entre la pérdida de pericitos o el nivel elevado de sPDGFRβ y el daño de la BHE. Los estudios futuros deberían probar un modelo SD extendido y examinar cambios simultáneos en los marcadores de otros componentes NVU o BBB. Además, se necesita un modelo animal que pueda usarse para apuntar con precisión a los pericitos capilares del SNC para estudiar las complejas interacciones celulares dentro de NVU y BBB durante la regulación normal o patológica del sueño/vigilia.

Identificamos daño y pérdida celular inducida por SD repetida en los pericitos cerebrales, un componente crítico de las células murales vasculares del cerebro. Es probable que estos cambios en los pericitos contribuyan a la degradación de la BHE y a la disfunción de la microcirculación cerebral durante la SD crónica. Por el contrario, nuestros hallazgos sugieren que la mejora del sueño podría proteger los pericitos y protegerlos contra afecciones patológicas relacionadas con los pericitos, como la enfermedad de Alzheimer, en el cerebro.

Cruzamos los ratones reporteros Pdgfrβ-P2A-CreERT2 (Jax # 030201) 24 y Ai14 tdTomato (Jax # 007914) para obtener los ratones Pdgfrβ-P2A-CreERT2/tdTomato, en los cuales el reportero tdTomato se expresará principalmente en pericitos después de la inducción con inyección de tamoxifeno (75 mg/kg de peso corporal, ip una vez cada 24 h durante un total de 5 días consecutivos). La cría y manipulación de animales siguió las políticas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Protocolo # IACUC-01399). Todos los ratones se alojaron en un ambiente de luz/oscuridad de 12 h/12 ​​h con luces encendidas en el tiempo zeitgeber 0 (ZT00) y se alimentaron ad libitum con comida y agua estándar para roedores. La temperatura ambiente y la humedad se mantuvieron entre 22 y 24 °C y entre 40 y 60%, respectivamente. Se asignaron aleatoriamente dos cohortes de ratones PDGFRβ-P2A-CreERT2/tdTomato de 6 a 8 meses de edad (incluidos ambos sexos) al grupo de control (SDC), al grupo de SD aguda (ASD), al grupo de SD repetida durante 10 días (RSD) y al grupo de SD aguda (ASD). grupo de recuperación (RSDR, RSD+ 3 semanas de recuperación), con 5 a 9 ratones en cada grupo. El marco temporal de la inducción de tamoxifeno, los procedimientos de SD y la recolección de tejido se enumeran en la Fig. 1. Se utilizó una cohorte de ratones para la recolección de LCR y la histología; la otra cohorte se utilizó para citometría de flujo.

Se privó de sueño a los ratones mediante un sistema automatizado de privación de sueño con una barra giratoria motorizada en el suelo de la jaula. La eficacia de dispositivos similares para producir SD ha sido validada previamente63,64. Brevemente, los ratones fueron alojados en grupos en jaulas que contenían una barra giratoria durante el experimento. Todos los ratones se aclimataron a estas nuevas jaulas encendiendo la barra giratoria (6 a 10 rpm) durante 5 minutos por hora durante la fase oscura (activa). Luego se produjo una ASD de 4 h (ZT00-04) o una RSD de 10 días (4 h/día, ZT00-04) activando la barra giratoria continuamente en los marcos de tiempo designados. La barra giratoria empuja suavemente y evita que los ratones se duerman sin aumentar significativamente su actividad locomotora. La barra giratoria permaneció quieta durante la fase luminosa (inactiva) para los ratones de control. Se grabaron en vídeo los comportamientos de los ratones durante la SD para confirmar que los procedimientos de SD no se interrumpieron y que los ratones se mantuvieron despiertos durante todo el procedimiento de SD.

Se recogió LCR de ratón como se describe en el protocolo de Lim65. Brevemente, bajo anestesia (inhalación de isoflurano al 1%), se expuso la cisterna magna mediante la extirpación de los músculos cercanos. Luego, se perforó un capilar de vidrio limpio en la cisterna magna y el LCR se introdujo automáticamente en el tubo capilar. Obtuvimos de 8 a 15 µl de LCR por ratón. Para evitar posibles fluctuaciones en la concentración de sPDGFRβ debido al tiempo circadiano, siempre recolectamos muestras de LCR en ZT05-06. Luego, se realizó el ensayo ELISA tipo sándwich estándar según el protocolo del fabricante (Abcam, Cambridge, MA). La placa se leyó inmediatamente en el lector BioTek Synergy 4. Las concentraciones de PDGFRβ soluble (sPDGFRβ) se calcularon utilizando las lecturas de las muestras y la ecuación de la curva estándar lineal. Los resultados se multiplicaron por el factor de dilución para llegar a la concentración final en las muestras de LCR originales.

Se realizó citometría de flujo para cuantificar pericitos en tejido cerebral de ratones según protocolos publicados26,28. Brevemente, se perfundieron a los ratones 10 ml de PBS y se recogieron la corteza cerebral bilateral, el hipocampo y el área subcortical (entre el colículo inferior y el cuerpo calloso anterior). El tejido cerebral se lavó con suero bovino fetal al 2%/solución salina tamponada con fosfato (FBS/PBS), se cortó en trozos de 1 mm de largo y se incubó en medio completo que contenía colagenasa/dispasa 3 mg/ml (Sigma, St Louis, MO) durante 45 min a 37 °C con agitación continua. Luego se trituró el tejido cerebral (pipeta hacia arriba y hacia abajo) ~100X con una pipeta P1000, y el sobrenadante se filtró y se centrifugó a 300 g durante 5 minutos. Los sedimentos se resuspendieron en Percoll al 22 % (Sigma, St Louis, MO) y se centrifugaron a 2600 g durante 10 min. Las células sanguíneas se eliminaron mediante tampón de lisis de glóbulos rojos (Sigma, St Louis, MO) y un filtro de células de 40 µm. Los sedimentos se resuspendieron en PBS con FBS al 2%/PBS y se midió la densidad celular. La citometría de flujo multicolor se realizó según técnicas estándar con un CytoFLEX LX (Beckman Coulter) utilizando filtros para tdTomato (pericitos), anexina V-Pacific Blue (Thermofisher, Waltham MA, para apoptosis) y yoduro de propidio (PI, Thermofisher, Waltham MA, para células muertas).

Inmediatamente después de la recolección del LCR, a los ratones se les perfundió transcardialmente una solución de PBS que contenía formalina al 10% y los cerebros se cortaron transversalmente a 40 µm de espesor en una compresa (Precisionary Instruments, Greenville, NC). Las secciones del cerebro se dividieron en cuatro conjuntos. Un conjunto de secciones se tiñó con Lectin-DyLight 488 (dilución 1:200, Thermofisher, Waltham MA) y anticuerpo monoclonal de conejo anti-CD13 (ab32570, dilución 1:4000, Abcam, Cambridge MA) para verificar las identidades de las células que expresan tdTomato y ubicaciones. Otras secciones se tiñeron con anticuerpo monoclonal de conejo anti-caspasa-3 escindida (dilución 1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA) para detectar células apoptóticas. Se utilizó IgG anti-conejo de burro Alexa Fluor-647 como anticuerpo secundario. Para el análisis cuantitativo de la densidad vascular, se escanearon 8 secciones coronales teñidas con lectina (2 en AP + 0,6; 2 en AP-0,9; 2 en AP-1,6; 2 en el nivel AP-2,3) y se tomaron imágenes de alta definición. utilizando el microscopio confocal Zeiss LSM 880. Luego, las imágenes se transfirieron al software NIH ImageJ. Con base en intensidades fluorescentes que oscilaban entre 0 y 255, los vasos sanguíneos se distinguieron de las señales de fondo estableciendo un umbral en 30, que fue constante en los tres grupos. Se examinaron las áreas corticales que cubren las cortezas motoras primaria y secundaria, las cortezas somatosensoriales primaria y secundaria y toda la estructura del hipocampo. La densidad del área vascular se determinó mediante la relación del área teñida con lectina con respecto a toda el área de interés66,67.

Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism 9.2 (GraphPad Software, Boston, MA). Se utilizó ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Bonferroni para comparar el nivel de sPDGFRβ en el LCR, la densidad de pericitos y la densidad del área vascular entre los grupos. La significación estadística se evaluó en el nivel p < 0,05 (dos colas)68.

Todos los procedimientos y cuidados de los animales siguieron las políticas establecidas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y se informaron de acuerdo con las pautas de ARRIVE. Todas las manipulaciones realizadas a los ratones fueron aprobadas por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur (protocolo n.º IACUC-2021-01399).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se pueden obtener del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Los autores agradecen a Jacob Kendrick por la ayuda en los experimentos de citometría de flujo.

Este proyecto fue apoyado por NIH RF1AG077570 (Liu), R21AG067445 (Liu), R01NS096151 (Liu) y R01GM130653 (Fan).

Departamento de Psiquiatría y Ciencias del Comportamiento, Universidad Médica de Carolina del Sur, Charleston, SC, 29425, EE. UU.

Yan Wu y Meng Liu

Patología y Medicina de Laboratorio, Universidad Médica de Carolina del Sur, Charleston, SC, 29425, EE. UU.

Pengfei Li y Hongkuan Fan

Neurociencia, Universidad Médica de Carolina del Sur, Charleston, SC, 29425, EE. UU.

Narayan Bhat

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ML y HF diseñaron el estudio; YW y PL realizaron investigaciones; Datos analizados de ML, HF y NB; ML escribió el artículo. Estos autores contribuyeron igualmente: YW y PL

Correspondencia a Meng Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wu, Y., Li, P., Bhat, N. et al. Efectos de la privación repetida del sueño sobre los pericitos cerebrales en ratones. Informe científico 13, 12760 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40138-0

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Recibido: 24 de marzo de 2023

Aceptado: 05 de agosto de 2023

Publicado: 07 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40138-0

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